Афінної хроматографії

(від лат. Affinis - родинний) (біоспеціфіч. Хроматографія, хроматографія по спорідненості), метод очищення і розділення білків, заснований на їх избират. взаємодій. з лігандом, ковалентно пов'язаних з інертним носієм. У кач-ве лігандів використовують сполуки. , Взаємодій. яких брало з розділяються в-вами засновано на біол. ф-ції останніх. Так, при поділі ферментів (для чого переважно. І застосовується А. х.) Лігандами служать їх субстрати, інгібітори або коферменти. Головна особливість, к-раю обумовлює високу ефективність А. х. , Полягає в тому, що поділ грунтується на відмінності не фіз. -хімія. ознак молекули (заряду, форми і розміру), а специфічний. функціональних св-в, що відрізняють даний фермент від безлічі ін. біополімерів.

Нерухома фаза в А. х. являє собою спеціально отримується сорбент, побудований зазвичай за схемою: носій - з'єднує ланка ( "ніжка") - специфічний. ліганд. Носієм служить найчастіше сефарозапроізводное агарози, що має поперечні зшивки. Приєднання до неї лиганда або "ніжки", що містять, як правило, аміногрупу, здійснюється після активації сефарози бромцианом:

Зміст лиганда коливається від 0, 1 до 10 мкмоль на 1 г вологого сорбенту. Сефароза, однак, малоустойчива до дії ряду хім. в-в і мікроорганізмів.

Стабільніші макропористі неорг.носії (кремнезем, скло) і орг. полімери. Якщо ліганд приєднується безпосередньо до носія, ефективність специфічний. взаємодій. з ферментом помітно знижується внаслідок просторів. труднощів. "Ніжка", як правило, усуває стеріч. перешкоди, віддаляючи ліганд від носія. Як і носій, вона повинна бути інертною і не впливати на процеси в ході А. х. , Чого, однак, не завжди вдається досягти. Напр. , Приєднання "ніжки" з поступовим зниженням р-ції призводить до утворення катіонної угруповання ізомочевіни, і сорбент набуває св-ва аніоніта. У кач-ве "ніжки" використовують зазвичай ді-і поліаміни,

амінокислоти, пептиди, олігосахариди.

лігандів можуть служити субстрати (напр., Крохмаль або глікоген при поділі амілаз), проте їх превращ. в ході А. х. , Що каталізує розділяються ферментом, постійно змінює св-ва сорбенту. Тому, як правило, застосовують аналоги субстратів, стійкі до подальшого превращ. , Т. Е. Інгібітори ферментів. Так, для виділення протеїназ використовують не розщеплюються ними пептиди D-амінокислот. Ефективні прир. інгібітори ферментів, напр. пепстатін - інгібітор аспартільних протеїназ. Іноді застосовують ліганди, що зв'язують великі групи споріднених ферментів (зокрема, кінази і дегідрогенази). Приклади таких "группоспеціфіч." лігандів-фарбники антрахінону, аналоги нікотінамідаденіндіну-клеотіда.

Відомі ліганди (напр., Похідні фенілборной к-ти), що імітують при взаємодій. з ферментом структуру перехідного комплексу з субстратом. Такі ліганди ефективні при виділенні серінових гидролаз.

Поділ в А. х. зазвичай проводять на хроматографіч. колонках; іноді розділяється суміш поміщають в посудину з сорбентом і витримують до повного зв'язування досліджуваного компонента.Потім сорбент (в колонці або посудині) промивають буферним розчином для видалення незв'язаних в-в, після чого десорбируют досліджуваний компонент. Десорбція (елюція) останнього зазвичай досягається підвищенням іонної сили, зміною рН буферного розчину або додаванням в нього орг. р-розчинника, що послаблює взаємодій. ліганд - фермент. Більш вибіркова десорбція розчином ліганда.

Крім ферментів, методом А. х. можна виділяти також токсини, рецептори, інгібітори, транспортні білки і ін. біологічно активні в-ва. Високою вибірковістю відрізняється т. Зв. іммуносорбція, при якій в кач-ве лиганда використовують антитіла, що володіють специфічністю до виділеним білків; особливо ефективні моноклональні антитіла.

Для поділу білків застосовується також ряд ін. Аналогічних методів. Т. зв. ковалентная хроматографія заснована на избират. освіті і подальшому розщепленні ковалентних зв'язків між які виділяються в-вом і носієм, напр. між білком з SH-групами і ртуть-орг. похідними агарози. Застосовується також лігандообменная хроматографія, при якій ферменти зв'язуються через функціональний іон металу з комплексоном, іммобілізованим на носії. Набула поширення гидрофобная хроматографія, при якій сорбент (напр., Фенілсефароза), що містить гідрофобні угруповання, вкраплені в гідрофільну матрицю, взаємодіє з гідрофобними ділянками, що містяться на пов-сті білків. Нерідко при цьому спостерігаються також іонообмінні взаємодій. , Як, напр. , При використанні в якості сорбенту алкіламіносефароз.

Избират. виділення гликопротеинов забезпечують іммобілізовані на носіях лектини - білки, специфічно взаємодіють з кінцевими моносахаридними ланками вуглеводних ланцюгів.Іммобілізовані субодиниці ряду білків з четвертинної структурою м. Б. використані для вилучення цих білків із складних сумішей внаслідок специфічний. межсуб'едінічних контактів. А. х. сформувалася як метод в кін. 60-х рр. 20 в.

Літ. : Туркова Я ... Аффинная хроматографія, пер. з англ ... М., 1980. В. М. Степанов.

Хімічна енциклопедія. - М.: Радянська енциклопедія. Під ред. І. Л. Кнунянц. 1988.